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方案概述

前言：

FDA发布了关于亚硝胺原料药相关杂质（NDSRI）推荐可接受摄入量限度值的最终指南（后称指南），该指南根据预测的致癌效力分类为NDSRI 杂质的AI限值提供了建议。2024年9月4日，FDA发布了关于人用药物中亚硝胺杂质控制的最新指南（《人用药中亚硝胺杂质控制》第二版本）。亚硝胺指南描述了两类亚硝胺——小分子亚硝胺和NDSRI。

盐酸普萘洛尔片等4种β受体拮抗剂药物主要用药方向为控制高血压、心绞痛、心肌梗死等情况，为高血压患者常备药品，其每日最大摄入量约为300mg/Day，而N-亚硝基普萘洛尔等四种杂质均是药物合成路线中的产生的杂质，在最新指南中其限量均为1500ng/Day。

本应⽤方案成功验证英国365集团官网LCMS-TQ9200三重四极杆液质联用系统分析4种β受体拮抗剂药物中的亚硝胺类杂质的结果。

关键词：三重四极杆液质联用系统；亚硝胺杂质。

1.仪器设备及试剂

1.1 液相串联质谱配置清单

表1 仪器配置清单表

序号	名称	数量
1	LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统	1台
2	P3600B 二元高压恒流泵	1台
3	CT3600 柱温箱	1台
4	AS3600 超高效自动进样器	1台
5	SmartLab CDS 2.0色谱使用工作站	1套
6	C18 1.7 μm 2.1x100 mm	1个

1.2 试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	甲醇	LC-MS级
2	甲酸	LC-MS级
3	N-亚硝基普萘洛尔	20mg
4	N-亚硝基美托洛尔	20mg
5	N-亚硝基艾司洛尔	20mg
6	N-亚硝基比索洛尔	20mg
7	盐酸普萘洛尔片	100mg*100片
8	酒石酸美托洛尔片	50mg*20片
9	盐酸艾司洛尔	1g
10	富马酸比索洛尔片	5mg*10片

1.3 实验材料及辅助设备

超声波清洗机；

涡旋混合器；

高速离心机。

2.实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 溶剂：0.2%甲酸溶液与甲醇的混合溶液（体积比40∶60），

2.1.2 杂质对照品贮备液：

取N-亚硝基普萘洛尔、N-亚硝基美托洛尔、N-亚硝基艾司洛尔和N-亚硝基比索洛尔对照品各约20 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，混匀，即得对照品贮备液。

2.1.3 盐酸普萘洛尔片供试品溶液

取盐酸普萘洛尔片，研细，取细粉适量（约相当于主成分50 mg），精密称定，置15 mL离心管中，精密加入溶剂10 mL，于3 000 r/min条件下涡旋5 min后再超声10 min，以10 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 酒石酸美托洛尔片供试品溶液

取酒石酸美托洛尔片，研细，取细粉适量（约相当于主成分100 mg），精密称定，置15 mL离心管中，精密加入溶剂5 mL，于3 000 r/min条件下涡旋5 min后再超声10 min，以10 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.5 盐酸艾司洛尔注射液供试品溶液：

取盐酸艾司洛尔注射液，精密量取1 mL（约相当于主成分0.1 g）至10 mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.6富马酸比索洛尔片供试品溶液：

取富马酸比索洛尔片，研细，取细粉适量（约相当于主成分20 mg），精密称定，置15 mL离心管中，精密加入溶剂2 mL，于3 000 r/min条件下涡旋5 min后再超声10 min，以10 000 r/min离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 实验条件

2.2.1液相方法条件

色谱柱：C18, 1.7 µm 2.1x100mm

流动相：A相：甲醇；B相：0.2%甲酸水

流速：0.2 mL/min

柱温：40 ℃

进样体积：5 µL

2.2.2质谱方法条件

表3 质谱离子源参数

离子源	参数
离子源电压	ESI+5500V
脱溶剂气流速	17000mL/min
雾化气流速	2000mL/min
气帘气流速	5000mL/min
碰撞气流速	800μL/min
脱溶剂气温度	450℃
气帘气温度	150℃

3.实验结果

3.1 标准品谱图

12分钟内完成4种亚硝胺类杂质的测定，各峰均有良好的峰形，无峰形拖尾现象，各化合物响应良好，符合实验测定需求。

图1 4种亚硝胺类杂质色谱图（10ng/mL）

3.2 线性范围

取亚硝胺类杂质标准物质混合溶液，逐级稀释到系列浓度制作标准曲线，线性范围0.1~20 ng/mL，线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²均大于0.995，各组分线性关系良好。

表5各化合物线性范围表

化合物	线性范围	线性相关系数R2
N-亚硝基普萘洛尔	0.1~20 ng/mL	0.999 90
N-亚硝基美托洛尔	0.1~20 ng/mL	0.996 84
N-亚硝基艾司洛尔	0.1~20 ng/mL	0.999 28
N-亚硝基比索洛尔	0.1~20 ng/mL	0.999 33

图2 化合物线性结果

3.3 检测限与定量限

本方法中各化合物在0.05 ng/mL和0.1 ng/mL信噪比远大于3和10，符合灵敏度要求。

表6 各化合物检出限与定量限信噪比

化合物	信噪比（S/N）
化合物	0.05 ng/mL	0.1 ng/mL
N-亚硝基普萘洛尔	22.417	36.185
N-亚硝基美托洛尔	18.956	35.588
N-亚硝基艾司洛尔	47.236	162.216
N-亚硝基比索洛尔	22.788	57.717

图3 化合物检出限色谱图

3.4 精密度

取0.2、2、20ng/mL三种浓度亚硝胺类杂质标准物质混合溶液，连续进样6针比较精密度；结果如下表所示，所有亚硝胺类杂质化合物均在4%以内，符合≤15%的精密度要求。

表7 各化合物精密度

化合物	浓度(ng/mL)	偏差RSD
N-亚硝基普萘洛尔	0.2	3.045%
	2	1.227%
	20	2.689%
N-亚硝基美托洛尔	0.2	1.729%
	2	2.534%
	20	1.420%
N-亚硝基艾司洛尔	0.2	2.189%
	2	2.287%
	20	0.930%
N-亚硝基比索洛尔	0.2	3.847%
	2	3.861%
	20	2.276%

图4 化合物精密度色谱图

3.5 回收率

取100ng/mL亚硝胺类杂质标准物质混合溶液，以4种药品供试品混合溶液稀释至10ng/mL连续进样6针比较回收率；结果如下表所示，所有亚硝胺类杂质化合物回收率均在85%-105%以内，符合80%-120%的回收率要求。

表8 各化合物回收率

化合物	加标浓度(ng/mL)	偏差RSD	回收率%
N-亚硝基普萘洛尔	10	2.343%	100.15%
N-亚硝基美托洛尔	10	3.242%	94.66%
N-亚硝基艾司洛尔	10	3.100%	88.86%
N-亚硝基比索洛尔	10	3.765%	88.11%

3.6 空白残留

取100ng/mL亚硝胺类杂质标准物质混合溶液，进样后不做另外洗针操作，以后一针空白溶剂进样检测该方法空白残留量，结果如下图所示，发现目标物无残留，符合小于定量下限浓度20%的空白残留量要求。

图5 化合物空白残留量色谱图

4.结论

本方法使用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相质谱联用系统，进行4种β受体拮抗剂药物中的亚硝胺类杂质的测定。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合要求，线性相关系数均大于0.995，精密度均在4%以内，加标回收率在85-105%之间，高浓度样本系统无残留，说明了该方法配备英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱质谱联用系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。

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