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方案概述

前言：

亚硝胺杂质是一类具有亚硝基与胺结合（R1N(-R2)-N=O）的化学结构的化合物，具有高潜在致突变致癌性。自华海缬沙坦事件以来，多种药品中相继检出小分子亚硝胺类杂质（如NDMA、NDEA、NDBA等）或与原料药相关的亚硝胺类杂质（NDSRI），使得监管机构和制药企业对该类杂质一直高度关注。

NDSRI(Nitrosamine drug substance-related impurities)是一类与原料药有着类似结构单元的亚硝胺类杂质，它可通过含仲胺或叔胺结构的原料药(或原料药片段)亚硝化形成。NDSRI杂质是每种原料药特有的杂质，通常因缺乏致癌性和致突变性研究数据，确定其在药品中的可接受水平极具挑战。2023年8月4日，FDA发布了亚硝胺原料药相关杂质推荐可接受摄入量（AI）限度值的控制指南，该指南根据预测的致癌效力分类为NDSRI杂质AI值提供了建议，同时相关的指南文件也一直在持续更新。

地氯雷他定（Desloratadine），又称AERIUS (先灵葆雅)/DENOSIN (美时)，属于三环长效型的第三代组织胺拮抗剂(Antagonist)，选择性作用在H1接受体，其化学名为8-氯-6, 11-二氢-11-(4-亚哌啶基)-5H-苯并[5, 6]庚烷[1, 2b]吡啶，分子式为C₁₉H₁₉N₂Cl。一般用于缓解慢性特发性荨麻疹及常年过敏性鼻炎的全身及局部症状。地氯雷他定因结构中含有仲胺，可能会产生相应的NDSRI杂质，推测其亚硝基杂质结构如下图1，根据FDA发布的亚硝胺原料药相关杂质推荐可接受摄入量控制指南中记载N-亚硝基-地氯雷他定AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值均为400ng/天。

图1 地氯雷他定及其N-亚硝基-地氯雷他定结构图

亚硝胺杂质AI值为400ng/天，结合地氯雷他定口服溶液已批准说明书规定的最大日剂量5mg/天计算，控制限度为80ppm。结合限度，开发了高效液相色谱法对地氯雷他定原料中的亚硝胺杂质进行测定，并且对方法采用英国365集团官网高效液相色谱仪LC3400系列配置紫外检测器进行相应的方法学验证，包括：专属性、线性、准确度、重复性、检测限等，结果显示该方法专属、灵敏。

关键词：地氯雷他定、高效液相色谱法、NDSRI杂质。

1.仪器设备及试剂

1.1液相配置清单

表1 高效液相色谱系统配置清单

序号	名称	数量
1	LC3400系列高效液相色谱仪	1台
2	P3400B 二元高压恒流泵	1台
3	CT3400 柱温箱	1台
4	AS3400 全自动进样器	1台
5	SmartLab NetCDS 色谱使用工作站	1套
6	C18 250x4.6 mm，5 μm	1个

1.2试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	乙腈	HPLC级
2	三氟乙酸	AR级
3	十二烷基硫酸钠	AR级
4	N-亚硝基-地氯雷他定	98.9%

1.3实验材料及辅助设备

超声波清洗机；

涡旋混合器。

2.实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 十二烷基硫酸钠水溶液:取0.865g十二烷基硫酸钠，三氟乙酸0.5mL，加水稀释至溶解在1000mL。

2.1.2 溶剂:同流动相（精密量取十二烷基硫酸钠水溶液570mL和乙腈430mL，混匀，即得。

2.1.3 线性溶液:取N-亚硝基-地氯雷他定对照品各适量，精密称定加流动相溶解并稀释至每1mL约含0.8μg的溶液，作为标准贮备液母液；然后精密量取标准贮备液1.0mL、1.5mL、2.0mL、4.0mL、10.0mL分别置于5个100mL容量瓶中，加流动相定容至刻度线，摇匀，配制成浓度为8ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、32ng/mL和80ng/mL标准系列工作曲线。

2.1.4 对照品溶液:取N-亚硝基-地氯雷他定对照品各适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含N-亚硝基-地氯雷他定16ng的溶液，作为对照品溶液。

2.2 样品配制

2.2.1 样品溶液

精密移取地氯雷他定原料滴剂适量，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含地氯雷他定0.2mg的溶液，作为样品溶液。

2.2.2 准确度溶液

准确度样品配制：取地氯雷他定原料约20mg，精密称定至100mL量瓶中，加入适量的N-亚硝基-地氯雷他定对照品溶液，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成100%加标样品，摇匀，即得，作为准确度溶液。

3.实验结果

3.1 专属性

图2 专属性测试谱图

说明：溶剂不干扰N-亚硝基-地氯雷他定检测，供试品溶液中其他杂质色谱峰亦不干扰N-亚硝基-地氯雷他定杂质测定。

3.2 线性测试

图3 N-亚硝基-地氯雷他定杂质测试色谱叠加图

图4 N-亚硝基-地氯雷他定杂质标准曲线图

说明：实验结果显示，N-亚硝基-地氯雷他定杂质测试曲线相关系数R值在0.999以上，满足试验要求。

3.3 重复性测试

图5 6针16ng/mL标准品重复性测试谱图

表3 6针16ng/mL标准品重复性测试数据

化合物名	保留时间（min）	峰面积(mAU*s)
N-亚硝基-地氯雷他定	15.426	2.917
	15.432	2.864
	15.414	2.838
	15.416	2.994
	15.423	2.856
	15.417	2.937
平均值	15.421	2.901
RSD（%）	0.045	2.043

说明：由上表数据可知，N-亚硝基-地氯雷他定保留时间重复性为0.045%；峰面积重复性为2.043%，重复性良好。

3.4 准确度测试

图6 地氯雷他定原料准确度叠加图

表4 地氯雷他定原料准确度（N-亚硝基-地氯雷他定）

水平	已有量（ng）	加入量（ng）	测得量（ng）	回收率（%）	平均值（%）	RSD（%）
100%	0.00	1611.52	1656.365	99.690	100.11	2.58
100%	0.00		1610.546	96.932
100%	0.00		1686.721	101.517
100%	0.00		1704.476	102.585
100%	0.00		1615.701	97.242
100%	0.00		1706.194	102.689

说明：6份样品中N_-亚硝基-地氯雷他定的回收率在97.24~102.69%，RSD为2.58%，本方法检测准确度及重复性良好。

3.5 检测限测试

图7 N-亚硝基-地氯雷他定浓度为8ng/mL对照品测试谱图

表5 N-亚硝基-地氯雷他定浓度为8ng/mL对照品测试数据

名称	保留时间(min)	峰面积(mAU*s)	信噪比
N-亚硝基-地氯雷他定	15.434	1.213	30.042

说明：根据上表N-亚硝基-地氯雷他定浓度为8ng/mL对照品测测试数据，3倍信噪比为检测限计算可知N-亚硝基-地氯雷他定检测限理论结果分别为0.7989ng/mL。

3.6 某厂家原料测试

图8 某厂家原料和口服溶液测试谱图

说明：某品牌原料中未检测出N-亚硝基-地氯雷他定。

4.结论

根据FDA日前发布的药物基质亚硝胺杂质（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允许摄入量设定的指南文件对地氯雷他定原料中亚硝胺杂质N-亚硝基-地氯雷他定进行研究。根据该文件计算AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值均为400ng/天，同时结合本品最大日剂量（5mg），在原料中的控制限度均为不得过80ppm。采用英国365集团官网高效液相色谱仪LC3400系列配置紫外检测器进行相应的方法学验证,用已验证的检测方法对原料样品进行检测未检出亚硝胺杂质N-亚硝基-地氯雷他定。以上数据均满足药典方法对于仪器的要求。

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