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方案概述

前言：

亚硝胺杂质是指一类常见的有机化合物，其结构中含有一个或多个亚硝基（-NO）基团。亚硝胺杂质通常在食品、饮料、药品以及化妆品等产品中存在。它们是由于食品加工过程中，其中含有的亚硝酸盐与氨基化合物（如氨基酸和蛋白质）反应生成的。亚硝胺杂质被认为具有潜在的致癌和致突变作用，因此对其进行监测和控制至关重要。根据亚硝胺结构可以将亚硝胺分为两类，一类是小分子亚硝胺如NDMA、NDEA等，另外一类是NDSRIs（药物成分相关亚硝胺），其与API结构相似或相关，由API或其片段中的胺基与物料中亚硝化试剂（如亚硝酸盐）反应生成。

利福平与利福喷丁均为治疗结核最常见的药物之一，其利福平合成路径中产生的与API片段相似的1-甲基-4-亚硝基哌嗪（MNP）与利福喷丁合成路径中产生的1-环戊基-4-亚硝基哌嗪均为亚硝胺杂质。

本方法通过英国365集团官网LC-MS TQ9200三重四极杆液质联用系统检测利福平与利福喷丁中MNP与CPNP，其中，MNP与CPNP线性范围均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，满足实验要求，完全适用于高效快速准确地检测利福平与利福喷丁中的MNP与CPNP含量。

关键词：液质联用；亚硝胺杂质；利福平、利福喷丁。

1.仪器配置

表1 仪器配置清单

仪器	数量
英国365集团官网LC3600系列高效液相色谱	1
英国365集团官网TQ9200系列三重四极杆质谱仪	1
涡旋混匀器	1
离心机	1

2.仪器方法

2.1 液相条件

色谱柱：phenomenex Kinetex F5 2.6 μm，3x100 mm

流动相：A相：甲醇

B相：水

流速：0.3 mL/min

柱温：40 ℃

进样体积：5 μL

2.2 质谱条件

本方法使用电喷雾离子源，离子源电压为5500 V，脱溶剂气流量为17000 mL/min，脱溶剂气温度为450 ℃，雾化气流量为2000 mL/min，气帘气流量为8000 mL/min，气帘气温度为150 ℃，碰撞气流量为800 μL/min。

2.3 化合物参数

表2 质谱化合物参数

化合物名称	扫描模式	前体离子	产物离子	DP（V）	CE（eV）	CXP（V）
MNP	+	130.2	100.2	48	12	11
MNP	+	130.2	58.1*	48	22	11
CPNP	+	184.3	154.3	30	12	11
CPNP	+	184.3	98.3*	30	18	11

注：带*为定量离子

3.方法学验证

3.1 实验结果

9.5分钟内完成利福平与利福喷丁中MNP与CPNP的测定，化合物均有良好的峰形，无常见的峰形拖尾现象，化合物响应良好，符合实验测定需求。

图1 实验结果总图

3.2 标准曲线

精确配制100 μg/mL MNP与CPNP混标，稀释至0.2μg/mL，逐级稀释为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL。

表2 标准曲线及线性范围

化合物	线性方程	R²	线性范围( ng/mL)
MNP	Y=125306.43*X+730.35	0.999 82	0-200
CPNP	Y=559701.56*X-13894.98	0.999 50	0-100

图2 MNP标准曲线图3 CPNP标准曲线

3.3 精密度

连续进样6针0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL分别检测该线性在低中高不同浓度的重复性，RSD小于3%，符合要求。

表2 精密度数据结果

浓度( ng/mL)	MNP	CPNP
浓度( ng/mL)	RSD(%,n=6)	RSD(%,n=6)
0.5	2.364	2.423
5	2.893	1.425
50	2.904	0.932

图4 MNP 6针重复性色谱图图5 CPNP 6针重复性色谱图

3.4 灵敏度

使用峰到峰方式计算0.1 ng/mL MNP信噪比为19.674，0.1 ng/mL CPNP信噪比为47.964，均大于10，符合要求。

表5 灵敏度数据结果

化合物	0.1 ng/mL信噪比
MNP	19.674
CPNP	47.964

图6 0.1 ng/mL色谱图

3.5 样品检测

取利福平与利福喷丁胶囊内容物配置成样品溶液，稀释后进液质联用系统分析，实验结果如下：

表6 样品含量检测结果

化合物	样品量( ng/mL)	RSD(%,n=3)
MNP	0.052	6.480
CPNP	0.137	2.120

图7 利福平中的MNP色谱图

图8 利福喷丁中的CPNP色谱图

在FDA公布的含有亚硝胺杂质的药物中，MNP与CPNP限值均为400 ng/day，其成人每日最大摄入量为300 mg。将利福平和利福喷丁处理完成的上清液进液质检测以后发现利福平溶出液中含有MNP含量为0.052 ng/mL；利福喷丁溶出液中CPNP含量为0.137 ng/mL，而假设每天摄入300 mg药物，则MNP摄入量为15.6 ng/day，CPNP摄入量为41.1 ng/day，均小于FDA规定的限值。

4.结论

经过以上内容的验证，说明本方法适用于检测利福平与利福喷丁中的MNP与CPNP，其中，MNP与CPNP线性范围均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，满足实验要求，完全适用于高效快速准确地检测利福平与利福喷丁中的MNP与CPNP含量。

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