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英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统测定鸡肉中硝基呋喃类代谢物残留

方案概述

前言：

硝基呋喃类抗生素曾以其卓越的广谱抗菌活性和相对低廉的成本，被广泛应用于畜牧业及水产养殖业中，作为促生长添加剂和治疗多种动物细菌性及原虫性感染疾病（如肠道感染、球虫病）的重要药物。其核心作用机制在于其代谢产生的活性衍生物能不可逆地抑制细菌乙酰辅酶A等多种酶系统，强力干扰微生物的糖代谢过程，最终导致病原体死亡。然而，由于硝基呋喃类药物及其代谢产物被证实具有潜在的“三致”作用（致癌、致畸、致突变）以及遗传毒性，对消费者健康构成严重威胁，并可能引发过敏反应,已全面禁止其在食用动物生产中的任何用途。硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速，原形药物在可食用组织中难以检出，但其代谢产物却能与组织大分子（如蛋白质）形成稳定的共价结合物（键合残留），从而长期蓄积于动物肌肉、肝脏、肾脏及蛋、奶等可食性产品中。因此直接检测这四种关键代谢物成为监控硝基呋喃类药物非法使用、评估食品中该类残留风险的核心手段和唯一有效途径。建立高灵敏、高选择性的硝基呋喃代谢物检测技术对于保障食品安全、维护消费者健康权益、确保动物源性产品顺利出口以及有效打击非法用药行为具有至关重要的意义。

我国食品安全国家标准《GB 31650-2019食品中兽药最大残留限量》中规定硝基呋喃类抗生素作为食品中禁止检出药物；同时食品安全国家标准《GB/T 21311-2007 动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》规定了4种硝基呋喃类代谢物液质检测方法。本应用方案成功验证了英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统满足鸡肉中4种硝基呋喃类代谢物残留的检测方法要求。

关键词：液相色谱串联质谱；硝基呋喃类代谢物；食品安全；兽药残留

1.仪器设备及试剂

1.1液相串联质谱配置清单

表1 仪器配置清单表

序号	名称	数量
1	LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统	1台
2	P3600B 二元高压恒流泵	1台
3	CT3600 柱温箱	1台
4	AS3600 超高效自动进样器	1台
5	SmartLab CDS 2.0色谱使用工作站	1套

1.2试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	甲醇	LC-MS级
2	乙腈	LC-MS级
3	甲酸	LC-MS级
4	盐酸	分析纯
5	乙酸乙酯	分析纯
6	乙酸铵	分析纯
7	2-硝基苯甲醛	分析纯
8	磷酸氢二钾	分析纯
9	二甲亚砜	分析纯
10	氟苯尼考胺	99%
11	3-氨基-2-恶唑酮（AOZ）	99%
12	AOZ-D₄	99%
13	5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）	99%
14	AMOZ-D₅	99%
15	1-氨基-乙内酰脲（AHD）	99%
16	AHD-¹³C₃	99%
17	氨基脲（SEM）	99%
18	SEM-¹³C,¹⁵N₂	99%

1.3实验材料及辅助设备

超声波清洗机；

涡旋混合器；

水浴氮吹仪；

水浴恒温振荡器；

高速离心机。

2.实验方法

2.1溶液配制

2.1.1 0.2 mol/L 盐酸溶液：取盐酸1.7 mL，加水稀释到100 mL。

2.1.2 2 mol/L 氢氧化钠溶液：取氢氧化钠80 g，用水溶解并稀释到1000 mL，混匀。

2.1.3 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛 1.5 g，用甲醇溶解并稀释至100 mL，混匀。

2.1.4 0.3 mol/L 磷酸钾溶液：取三水磷酸钾39.95 g，用水溶解并稀释至500 mL，混匀。

2.1.5 乙腈饱和正己烷溶液：取适量的正己烷，加入过量的正己烷溶液，充分震荡分层，取上层正己烷溶液。

2.2样本前处理

2.2.1样本水解与衍生

称取试料2g(准确至±0.01g)，于50 mL聚丙烯离心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，涡旋振荡10 min，4000 rpm 离心10 min，弃去上清液。准确加混合内标工作液100 µL，涡旋1 min，加盐酸溶液10 mL、2-硝基苯甲醛溶液100 µL，涡旋混合1 min，置于水浴恒温振荡器中，37℃避光振荡16 h。

2.2.2样本净化

取出离心管冷却至室温，加入2 mL0.3mol/L磷酸钾溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.4，加乙酸乙酯15 mL，涡旋振荡1 min，6000 rpm 离心5 min，收集乙酸乙酯层至15 mL聚丙烯离心管中，40℃氮气吹干。加0.1%甲酸水溶液1 mL溶解残留物，再用3 mL乙腈饱和正己烷除脂，下层水相过0.22 µm有机滤膜，待进样。

2.2.3基质标线配制

称取5份阴性试料2g(准确至±0.01g)，于50 mL聚丙烯离心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，涡旋振荡10 min，4000 rpm 离心10 min，弃去上清液。残留物中准确加入适量标准品，最终配制浓度分别为0.5、1、2、5、10、20ng/mL，余下步骤如上述样本处理方法相同。

2.3实验条件

2.3.1液相方法条件

色谱柱：C18 1.7μm 2.1x50mm

流动相：A相：甲醇；B相：2 mM乙酸铵水

流速：0.3 mL/min

柱温：35 ℃

进样体积：5 µL

2.3.2质谱方法条件

表3 质谱离子源参数

离子源	参数
离子源电压	ESI+5000 V
脱溶剂气流速	15000 mL/min
雾化气流速	2000 mL/min
气帘气流速	5000 mL/min
碰撞气流速	800 μL/min
脱溶剂气温度	500 ℃
气帘气温度	150 ℃

3实验结果

3.1标准品谱图

7分钟内完成4种硝基呋喃类抗生素代谢物及内标的测定，各峰均有良好的峰形，无峰形拖尾现象，各化合物响应良好，符合实验测定需求。

图1 4种硝基呋喃类抗生素代谢物及内标色谱图（0.5 ng/mL）

3.2线性范围

取适量硝基呋喃类代谢物混合标准溶液，按照样品水解、衍生、净化步骤前处理制作标准曲线，采用同位素内标法进行定量分析，线性范围为0.5-20 ng/mL，线性检测结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²范围在0.9984~0.9999之间，均大于0.99，各组分线性关系良好。

表4各化合物线性范围表

化合物	线性范围	回归方程	线性相关系数R²
AOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.250X+0.001	0.9984
AMOZ	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.030	0.9999
AHD	0.5-20 ng/mL	Y=0.238X-0.010	0.9996
SEM	0.5-20 ng/mL	Y=0.255X+0.014	0.9998

图2 4种化合物线性结果

3.3检测限与定量限

食品安全国家标准GB/T 21311-2007中规定本方法中4种硝基呋喃类代谢物的检测限为0.5 µg/kg，定量限为1 µg/kg。本方法中各化合物在检测限与定量限规定浓度下信噪比大于3和10，符合国标中灵敏度要求。

表5 各化合物检测限与定量限

化合物	信噪比（S/N）
化合物	检测限	定量限
AOZ	54.99	126.00
AMOZ	31.35	101.98
AHD	47.08	109.69
SEM	12.00	40.82

图3 4种化合物检测限与定量限色谱图

3.4精密度测试

取低中高三种浓度硝基呋喃类代谢物混合溶液，连续进样6针比较保留时间与峰面积偏差，结果如下表所示，所有硝基呋喃类代谢物保留时间偏差均小于1%，峰面积偏差均小于5%，符合国标的RSD≤15%的精密度要求。

表6 各化合物精密度测试

化合物	浓度(ng/mL)	保留时间偏差RSD(%，n=6)	峰面积偏差 RSD(%，n=6)
AHD	1	0.24	4.78
	2	0.44	3.46
	5	0.39	2.45
AOZ	1	0.19	2.42
	2	0.36	3.04
	5	0.55	2.50
SEM	1	0.20	2.58
	2	0.44	3.65
	5	0.46	2.66
AMOZ	1	0.14	2.91
	2	0.49	2.03
	5	0.46	2.63

图4 4种硝基呋喃类代谢物精密度色谱图

3.5基质加标回收率测试

采用加标回收试验评估该检测项目的正确度：测定各检测指标的浓度，将已知浓度的标准品按不同比例加到空白基质样品中进行前处理，制作高、中、低三个不同浓度的基质加标样品。每个浓度的加标样品独立测定6次，通过检测加标前后基质中的浓度，计算回收率，评估该项目的准确度。结果如下所示：鸡肉基质中各化合物加标回收率在88.32-105.05%之间，CV在5%以内，准确度符合方法要求。

表7 鸡肉基质中各化合物加标回收率

化合物	加标量(ng/mL)	测得量（ng/mL）	平均回收率（%，n=6）	CV（%，n=6）
AHD	2.00	1.98	99.13	2.52
	4.00	4.20	105.05	2.50
	10.00	10.39	103.92	3.38
AOZ	2.00	1.77	88.32	3.72
	4.00	3.70	92.57	4.32
	10.00	9.59	95.86	2.59
SEM	2.00	1.98	98.96	3.95
	4.00	4.08	102.06	4.42
	10.00	10.47	104.68	0.89
AMOZ	2.00	1.87	93.48	2.91
	4.00	4.06	101.45	1.27
	10.00	10.40	104.00	1.04

3.6样品测试

公司附近超市随机购买鸡胸肉样品，经上述样品前处理方法提取、净化，样品上机测试，4种硝基呋喃类代谢物对应保留时间均无色谱峰测出，其他色谱峰为衍生化后杂质，结果表明鸡胸肉样品4种硝基呋喃类代谢物均未检出。

图5 超市鸡胸肉样品中4种硝基呋喃类代谢物化合物色谱图

4结论

本方法使用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统，进行动物源食品中硝基呋喃类代谢物含量的测定。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合国标要求，线性相关系数均大于0.99，连续6针各化合物保留时间偏差在1%以内，峰面积偏差均在5%以内，精密度良好；鸡肉基质加标回收率在88.3-105.1% 之间，CV在5%以内；超市随机购买鸡胸肉样品，上机测试4种硝基呋喃类代谢物均未检出。说明了该方法配备英国365集团官网液相色谱串联质谱系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。

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