方案概述
前言：
亚硝胺杂质是一类具有亚硝基与胺结合（R1N(-R2)-N=O）的化学结构的化合物，具有高潜在致突变致癌性。多种药品中相继检出小分子亚硝胺类杂质（如NDMA、NDEA、NDBA等）或与原料药相关的亚硝胺类杂质（NDSRI），使得监管机构和制药企业对该类杂质一直高度关注。盐酸普萘洛尔是一种非选择性β肾上腺素受体阻滞剂，化学式为C16H22ClNO2，CAS号为3506-09-0，分子量295.804，常温下为白色或类白色结晶性粉末。其通过拮抗β1和β2受体降低心率、抑制心肌收缩及传导，减少心肌耗氧量，临床制剂包括片剂和注射液 。盐酸普萘洛尔片为非选择性β-受体阻断药，阻断心肌的β受体，对β1和β2受体均有拮抗作用。减慢心率，抑制心脏收缩力与传导、循环血量减少、心肌耗氧量降低。临床主要用于治疗多种原因所致的心律失常，也可用于心绞痛高血压嗜铬细胞瘤（手术前准备）等，由于拮抗β2受体可引起支气管痉挛和哮喘，故本品禁用于支气管哮喘的病人。普萘洛尔因结构中含有仲胺，可能会产生相应的NDSRI杂质，推测其亚硝基杂质结构如下图1，根据FDA发布的亚硝胺原料药相关杂质推荐可接受摄入量控制指南中记载N-亚硝基-普萘洛尔AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值为1500ng/天。
图1 普萘洛尔（上图）与N-亚硝基-普萘洛尔（下图）结构图
亚硝胺杂质AI值为1500ng/天，结合盐酸普萘洛尔片已批准说明书规定的最大日剂量200mg/天计算，控制限度为不得过7.5ppm。结合限度，开发了高效液相色谱法对盐酸普萘洛尔片中的亚硝胺杂质进行测定，并且对方法采用英国365集团官网高效液相色谱仪配置紫外检测器进行相应的方法学验证，包括：专属性、线性、准确度、重复性、检测限等，结果显示该方法专属、灵敏、可靠。
关键词：普萘洛尔；高效液相色谱法；亚硝胺类杂质
1.仪器设备及试剂
1.1液相配置清单
表1 高效液相色谱系统配置清单
|
序号 |
名称 |
数量 |
|
1 |
UV3400 紫外检测器 |
1台 |
|
2 |
P3400B 四元低压恒流泵 |
1台 |
|
3 |
CT3400 柱温箱 |
1台 |
|
4 |
AS3400 全自动进样器 |
1台 |
|
5 |
SmartLab NetCDS 色谱使用工作站 |
1套 |
|
6 |
C18 250x4.6 mm，5 μm |
1个 |
1.2试剂及标准品清单
表2 试剂及标品清单表
|
序列 |
试剂及标准品 |
纯度 |
|
1 |
乙腈 |
HPLC级 |
|
2 |
十二烷基硫酸钠 |
AR级 |
|
3 |
磷酸二氢四丁基铵 |
AR级 |
|
4 |
氢氧化钠 |
AR级 |
|
5 |
硫酸 |
AR级 |
|
4 |
N-亚硝基-普萘洛尔 |
99.85% |
1.3实验材料及辅助设备
超声波清洗机；
涡旋混合器
2.实验方法
2.1溶液配制
2.1.1 2mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，加水50mL溶解，混匀，即得。
2.1.2乙腈-水-硫酸（55：45：0.1）的混合液：取十二烷基硫酸钠1.6g与磷酸二氢四丁基铵0.31g，加入1mL硫酸、450mL水和550mL乙腈，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH3.3，混匀，即得。
2.1.3溶剂：同流动相。
2.1.4 线性溶液：取N-亚硝基-普萘洛尔对照品适量，精密称定加流动相溶解并稀释至每1mL约含200ng的溶液，作为标准贮备液母液；然后精密量取标准贮备液适量分别置于6个100mL容量瓶中，加流动相定容至刻度线，摇匀，配制成浓度为0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL和6ng/mL标准系列工作曲线。
2.1.5对照品溶液：取N-亚硝基-普萘洛尔对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含N-亚硝基-普萘洛尔2ng的溶液，作为对照品溶液。
2.2样品配制
2.2.1 样品溶液
精密称取盐酸普萘洛尔片细粉适量，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含普萘洛尔0.27mg的溶液，作为样品溶液。
2.2.2 准确度溶液
取盐酸普萘洛尔片细粉约297mg，精密称定至100mL量瓶中，加入适量的N-亚硝基-普萘洛尔对照品溶液，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成100%加标样品，摇匀，即得，作为准确度溶液。
3实验结果
3.1专属性
图2 专属性测试谱图
说明：溶剂不干扰N-亚硝基-普萘洛尔检测，供试品溶液中其他杂质色谱峰亦不干扰N-亚硝基-普萘洛尔杂质测定。
3.2线性测试
图3 N-亚硝基-普萘洛尔杂质标准曲线图
说明：实验结果显示，N-亚硝基-普萘洛尔杂质测试曲线相关系数R值在0.999以上，满足试验要求。
3.3 重复性测试
图4 6针2ng/mL标准品重复性测试谱图
表3 6针2ng/mL标准品重复性测试数据
|
化合物名 |
保留时间（min） |
峰面积(mAU*s) |
|
N-亚硝基-普萘洛尔 |
2.935 |
3.963 |
|
2.934 |
3.979 |
|
|
2.933 |
3.984 |
|
|
2.932 |
3.964 |
|
|
2.932 |
3.996 |
|
|
2.932 |
3.944 |
|
|
平均值 |
2.933 |
3.972 |
|
RSD（%） |
0.043 |
0.464 |
说明：由上表数据可知，N-亚硝基-普萘洛尔保留时间重复性为0.043%；峰面积重复性为0.464%，重复性良好。
3.4 准确度测试
图5 片剂中N-亚硝基-普萘洛尔准确度叠加图
表4 盐酸普萘洛尔片准确度（N-亚硝基-普萘洛尔）
|
水平 |
已有量（ng） |
加入量（ng） |
测得量（ng） |
回收率（%） |
平均值（%） |
|
100% |
0.00 |
200.00 |
201.662 |
100.831 |
101.38 |
|
100% |
0.00 |
197.331 |
98.666 |
||
|
100% |
0.00 |
193.958 |
96.979 |
||
|
100% |
0.00 |
206.093 |
103.046 |
||
|
100% |
0.00 |
209.416 |
104.708 |
||
|
100% |
0.00 |
208.157 |
104.079 |
说明：6份样品中N-亚硝基-普萘洛尔的回收率在96.98~104.71%，平均回收率为101.38%，本方法检测准确度及重复性良好。
3.5 检测限测试
图6 N-亚硝基-普萘洛尔浓度为2ng/mL对照品测试谱图
表5 N-亚硝基-普萘洛尔浓度为2ng/mL对照品测试数据
|
名称 |
保留时间(min) |
峰面积(mAU*s) |
信噪比 |
|
N-亚硝基-美托洛尔 |
2.946 |
3.994 |
39.689 |
说明：根据上表N-亚硝基-普萘洛尔浓度为2ng/mL对照品测试数据，3倍信噪比为检测限计算可知N-亚硝基-普萘洛尔检测限理论结果为0.151ng/mL。
3.6 某厂家片剂测试
图7 某厂家片剂测试谱图
说明：某厂家片剂中未检测出N-亚硝基-普萘洛尔。
4．结论
根据FDA日前发布的药物基质亚硝胺杂质（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允许摄入量设定的指南文件对盐酸普萘洛尔片剂中亚硝胺杂质N-亚硝基-普萘洛尔进行研究。根据该文件计算AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值为1500ng/天，同时结合本品最大日剂量（200mg），在片剂中的控制限度为不得过7.5ppm。采用英国365集团官网高效液相色谱仪系列配置紫外检测器进行相应的方法学验证,用已验证的检测方法对片剂样品进行检测未检出亚硝胺杂质N-亚硝基-普萘洛尔。以上数据均满足药典方法对于仪器的要求。
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