方案概述
前言：
亚硝胺杂质是一类具有亚硝基与胺结合（R1N(-R2)-N=O）的化学结构的化合物，具有高潜在致突变致癌性。自华海缬沙坦事件以来，多种药品中相继检出小分子亚硝胺类杂质（如NDMA、NDEA、NDBA等）或与原料药相关的亚硝胺类杂质，使得监管机构和制药企业对该类杂质一直高度关注。富马酸比索洛尔片的主要成份为富马酸比索洛尔，其化学名称为：1-[4-[[2-（1-甲基乙氧基）乙氧基]甲基]-苯氧基]-3-[（1-甲基乙基）胺基]-2-丙醇富马酸盐，分子式为（C18H31NO4)2·C4H4O4。其主要适应症为高血压．冠心病（心绞痛）。伴有心室收缩功能减退（射血分数≤35%，根据超声心动图确定）的中度至重度慢性稳定性心力衰竭。在使用本品前，需要遵医嘱接受ACE抑制剂、利尿剂和选择性使用强心甙类药物治疗。比索洛尔因结构中含有仲胺，可能会产生相应的亚硝胺（NDSRI）杂质，其亚硝胺杂质N-亚硝基-比索洛尔结构如下图1，根据FDA发布的亚硝胺原料药相关杂质推荐可接受摄入量控制指南中记载N-亚硝基-比索洛尔AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值为1500ng/天。
图1 比索洛尔及其N-亚硝基-比索洛尔结构图
N-亚硝基-比索洛尔AI值为1500ng/天，结合富马酸比索洛尔片已批准说明书规定的最大日剂量10mg/天计算，控制限度为150ppm。结合限度，开发了高效液相色谱法对富马酸比索洛尔片中的亚硝胺杂质N-亚硝基-比索洛尔进行测定，并且对方法采用英国365集团官网高效液相色谱仪LC3400系列配置紫外检测器进行相应的方法学验证，包括：专属性、线性、准确度、重复性、检测限等，结果显示该方法专属、灵敏。
关键词：比索洛尔；高效液相色谱法；亚硝胺杂质
1.仪器设备及试剂
1.1液相配置清单
表1 高效液相色谱系统配置清单
|
序号 |
名称 |
数量 |
|
1 |
UV3400 紫外检测器 |
1台 |
|
2 |
P3400B 二元高压恒流泵 |
1台 |
|
3 |
CT3400 柱温箱 |
1台 |
|
4 |
AS3400 全自动进样器 |
1台 |
|
5 |
SmartLab NetCDS 色谱使用工作站 |
1套 |
|
6 |
C18 250x4.6 mm，5 μm |
1个 |
1.2试剂及标准品清单
表2 试剂及标品清单表
|
序列 |
试剂及对照品 |
纯度 |
|
1 |
乙腈 |
HPLC级 |
|
2 |
磷酸二氢铵 |
AR级 |
|
3 |
磷酸 |
AR级 |
|
4 |
N-亚硝基-比索洛尔对照品 |
99.4% |
1.3实验材料及辅助设备
超声波清洗机；
涡旋混合器
2.实验方法
2.1溶液配制
2.1.1 磷酸盐缓冲液：称磷酸二氢铵3.45g，加水900mL，用磷酸调节pH值至2.5，加水稀释至1000mL。
2.1.2 溶剂：磷酸盐缓冲液：乙腈=(85:15)。
2.1.3 线性溶液：取N-亚硝基-比索洛尔对照品适量，精密称定加流动相溶解并稀释至每1mL约含1000ng的溶液，作为标准贮备液母液；精密量取标准贮备液适量，加流动相定容至刻度线，摇匀，配制成浓度为15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL标准系列线性溶液。
2.1.4对照品溶液：取N-亚硝基-比索洛尔对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含N-亚硝基-比索洛尔30ng的溶液，作为对照品溶液。
2.2样品配制
2.2.1 样品溶液
精密称取富马酸比索洛尔细粉（约相当于比索洛尔5mg）适量，置25mL量瓶中，用流动相溶解并稀释制成每1mL约含比索洛尔0.2mg的溶液，作为样品溶液。用滤膜过滤后上机。
2.2.2 准确度溶液
精密称取富马酸比索洛尔细粉（约相当于比索洛尔5mg）适量，置25mL量瓶中，加入适量的N-亚硝基-比索洛尔对照品溶液，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成100%加标样品，摇匀，即得，作为准确度溶液。用滤膜过滤后上机。
3实验结果
3.1专属性
图2 专属性测试谱图
说明：溶剂不干扰N-亚硝基-比索洛尔检测，供试品溶液中其他杂质色谱峰亦不干扰N-亚硝基-比索洛尔杂质测定。
3.2线性测试
图3 N-亚硝基-比索洛尔杂质测试色谱叠加图
 |
说明：实验结果显示，N-亚硝基-比索洛尔杂质测试线性相关系数R值在0.9999以上，满足试验要求。
3.3 重复性测试
图5 6针30ng/mL标准品重复性测试谱图
表3 6针30ng/mL标准品重复性测试数据
|
化合物名 |
保留时间（min） |
|
N-亚硝基-比索洛尔 |
13.958 |
|
13.963 |
|
|
13.968 |
|
|
13.973 |
|
|
13.966 |
|
|
13.948 |
|
|
平均值 |
13.963 |
|
RSD（%） |
0.063 |
说明：由上表数据可知，N-亚硝基-比索洛尔保留时间重复性为0.063%，重复性良好。
3.4 准确度测试
图6 片剂中N-亚硝基-比索洛尔准确度叠加图
表4 富马酸比索洛尔片准确度（N-亚硝基-比索洛尔）
|
水平 |
已有量（ng） |
加入量（ng） |
测得量（ng） |
回收率（%） |
平均值（%） |
|
100% |
0.00 |
723.135 |
728.303 |
100.715 |
99.38 |
|
100% |
0.00 |
739.090 |
102.206 |
||
|
100% |
0.00 |
799.763 |
110.597 |
||
|
100% |
0.00 |
662.237 |
91.579 |
||
|
100% |
0.00 |
708.528 |
97.980 |
||
|
100% |
0.00 |
673.922 |
93.195 |
说明：6份样品中N-亚硝基-比索洛尔的回收率在91.58~110.60%，平均回收率为99.38%，本方法检测准确度良好。
3.5 检测限测试
图7 N-亚硝基-比索洛尔浓度为30ng/mL对照品测试谱图
表5 N-亚硝基-比索洛尔浓度为30ng/mL对照品测试数据
|
名称 |
保留时间(min) |
峰面积(mAU*s) |
信噪比 |
|
N-亚硝基-比索洛尔 |
13.973 |
3.023 |
30.324 |
说明：根据上表N-亚硝基-比索洛尔浓度为30ng/mL对照品测测试数据，3倍信噪比为检出限计算可知N-亚硝基-比索洛尔检测限理论结果为2.9679ng/mL。
3.6 某厂家片剂测试
图8 某厂家片剂测试谱图
说明：某厂家片剂中未检测出N-亚硝基-比索洛尔。
4．结论
根据FDA日前发布的药物基质亚硝胺杂质（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允许摄入量设定的指南文件对富马酸比索洛尔片中亚硝胺杂质N-亚硝基-比索洛尔进行研究。根据该文件计算AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值均为1500ng/天，同时结合本品最大日剂量（10mg），在片剂中的控制限度为不得过150ppm。采用英国365集团官网高效液相色谱仪LC3400系列配置紫外检测器进行相应的方法学验证。用已验证的检测方法对富马酸比索洛尔片样品进行检测，未检出亚硝胺杂质N-亚硝基-比索洛尔。以上数据均满足药典方法对于仪器的要求。
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