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方案概述

前言：

对羟基苯甲酸酯类（尼泊金酯类）作为一类高效、广谱的防腐剂，广泛应用于食品（如酱油、醋、饮料、果酱等）、化妆品及医药领域，其抑菌效果与安全性直接关系到产品的稳定性和消费者健康。该类物质包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、异丙酯、异丁酯及庚酯等7种常见衍生物，其抗菌活性随酯基碳链增长而增强，且在pH 4-8范围内均能保持稳定效果，成为酸性防腐剂的重要替代品。近年来，研究发现对羟基苯甲酸酯类可能具有潜在的雌激素活性，长期摄入或接触可能与内分泌干扰效应相关，部分异构体（如异丙酯、异丁酯）的毒性甚至高于直链同系物。尽管其在体内代谢迅速（通过水解为对羟基苯甲酸后经尿液排出），但环境残留问题逐渐显现，如在水体和土壤中难降解的特性可能引发生态累积风险。

本次实验参考《GB 5009.31-2025 食品安全国家标准食品中对羟基苯甲酸脂类化合物的测定》，采用英国365集团官网高效液相色谱仪LC3500系列配置DAD检测器进行检测。实验结果显示，系统适用性测试，各化合物峰型良好，理论塔板数高，满足实验要求；连续进样6次浓度为1.0mg/L对羟基苯甲酸酯类化合物标准工作溶液，保留时间重复性均在0.2%以下，峰面积重复性均在1.0%以下，重复性良好；在0.2~50mg/L范围内，线性相关系数均大于0.9999，线性良好；加标样品中7种对羟基苯甲酸酯类化合物的回收率在97.6~104.8%之间，准确度良好；试样测试未检出7种对羟基苯甲酸酯类化合物。以上数据均满足标准方法对于仪器的要求。

关键词：食品添加剂；对羟基苯甲酸酯类；尼泊金酯类；高效液相色谱。

1.仪器设备及试剂

1.1高效液相色谱配置清单

表1 仪器配置清单表

序号	名称	数量
1	LC3500液相色谱系统	1台
2	P3500B 双三元梯度泵	1台
3	CT3500 柱温箱	1台
4	AS3500 自动进样器	1台
5	DAD3500 检测器	1台
6	SmartLab CDS 2.0色谱使用工作站	1套
7	Nova Atom C18柱3μm 4.6x150mm	1个

1.2试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	甲醇	色谱纯
2	乙腈	色谱纯
3	对羟基苯甲酸酯类化合物混标（1000mg/L）	/
4	磷酸	分析纯

1.3实验材料及辅助设备

分析天平；

超声波清洗机；

涡旋混合器

2.实验方法

2.1试剂配制

2.1.1 对羟基苯甲酸酯类化合物混合标准工作液：分别吸取对羟基苯甲酸酯类化合物混标适量，用30%甲醇水稀释成质量浓度分别为0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L的混合标准工作液。

2.1.2 样品前处理：称取5g(精确至0.01g)试样于50 mL刻度离心管内(碳酸饮料需在超声波清洗器中超声脱气 10min再称样)，加入甲醇-水溶液(3+7)30mL，涡旋3min，超声20min，再加入甲醇-水溶液(3+7)至 40mL，6000r/min离心3min，过滤上清液，取滤液待净化。分别用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将待净化的溶液转入已活化的固相萃取柱中，依次用5mL水和5mL甲醇-水溶液(3+7)淋洗，用6mL甲醇洗脱，收集洗脱液，加水定容至10mL，过滤膜，供高效液相色谱仪测定。

3实验结果

3.1系统适用性测试

图1 对羟基苯甲酸酯类化合物标准工作溶液测试色谱图

表3 对羟基苯甲酸酯类化合物标准工作溶液测试结果

化合物	保留时间(min)	理论塔板数	分离度
对羟基苯甲酸甲酯	11.558	15943	15.276
对羟基苯甲酸乙酯	16.575	52038	13.497
对羟基苯甲酸异丙酯	21.167	47190	2.161
对羟基苯甲酸丙酯	22.008	51205	13.168
对羟基苯甲酸异丁酯	27.692	54566	1.566
对羟基苯甲酸丁酯	28.267	189191	11.862
对羟基苯甲酸庚酯	30.792	552047	n.a.

系统适用性测试显示：各峰峰型良好，理论塔板数高，周围无杂峰干扰，分离度均大于1.5以上，满足实验要求。

3.2重复性测试

图2 1.0mg/L对羟基苯甲酸酯类化合物6针重复性测试谱图

表4 1.0mg/L对羟基苯甲酸酯类化合物6针重复性测试结果

化合物	保留时间RSD（%）	峰面积RSD（%）
对羟基苯甲酸甲酯	0.129	0.286
对羟基苯甲酸乙酯	0.090	0.127
对羟基苯甲酸异丙酯	0.110	0.145
对羟基苯甲酸丙酯	0.111	0.136
对羟基苯甲酸异丁酯	0.108	0.708
对羟基苯甲酸丁酯	0.129	0.239
对羟基苯甲酸庚酯	0.037	0.901

重复性测试显示：连续进样6次浓度为1.0mg/L对羟基苯甲酸酯类化合物标准工作溶液，保留时间重复性均在0.2%以下；峰面积重复性均在1.0%以下，重复性良好。

3.3线性测试

图3 标准曲线测试谱图

线性测试显示：在0.2~50mg/L范围内，7种对羟基苯甲酸酯类化合物混合标准曲线线性相关系数均＞0.9999，线性良好。

3.4准确度测试

图4 准确度测试谱图

表5 对羟基苯甲酸酯类化合物准确度测试结果

水平	已有量（μg/mL）	加入量（μg/mL）	测得量（μg/mL）	回收率（%）
对羟基苯甲酸甲酯	0.0	1.0	1.029	102.9
对羟基苯甲酸乙酯			1.034	103.4
对羟基苯甲酸异丙酯			1.031	103.1
对羟基苯甲酸丙酯			1.031	103.1
对羟基苯甲酸异丁酯			1.028	102.8
对羟基苯甲酸丁酯			0.976	97.6
对羟基苯甲酸庚酯			1.048	104.8

准确度测试显示：加标样品中7种对羟基苯甲酸酯类化合物的回收率在97.6~104.8%之间，准确度良好。

3.5某品牌饮料测试

图5 某品牌饮料测试谱图

样品测试显示：某品牌饮料中未检测出7种对羟基苯甲酸酯类化合物。

4.结论

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